Enzimas de restricción

Enzimas de Restricción

· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

· Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).


· Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

· Existen 3 tipos de enzimas de restricción:


1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.

· Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

· Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:

Eco RI à E = género Escherichia

co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

· Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:
1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.